Robert De Niro 1943. augusztus 17-én született Greenwich Village-ben, New York Cityben. Művészcsaládba született, édesanyja, Virginia Holton Admiral festő és költő, édesapja, Robert De Niro Sr. absztrakt expresszionista festő és szobrász volt. Ereiben angol, német, francia, holland, olasz és ír vér is csörgedezik.
Első filmszerepét mindössze 20 évesen kapta meg Brian de Palma (1969) filmjében. Ezt követően kezdődött meg hosszú éveken át tartó együttműködése Martin Scorsesével; első közös filmjük az Aljas utcák (1973) volt. 1974-ben Francis Ford Coppola Keresztapa-trilógiájának második részében a fiatal Vito Corleonét formálta meg. Alakításával a legjobb férfi mellékszereplő Oscar-díját érdemelte ki, azonban De Niro nem volt jelen a ceremónián. Az Akadémia történelmében máig egyedülálló, hogy Marlon Brando és Robert De Niro ugyanazon karakter megformálásáért, vagyis Vito Corleone szerepéért kapták meg az Aranyszobrot.
Az Aljas utcák sikere után Scorsese és De Niro évtizedeken át tartó munkakapcsolata olyan filmeket adott az utókornak, mint a Taxisofőr (1976), a New York, New York (1977), a Dühöngő bika (1980), melyben Jake La Motta karakterének megformálásáért megkapta a legjobb férfi főszereplőnek járó Oscar-díjat, továbbá A komédia királya (1983), Cape Fear - A rettegés foka (1991) és a Casino (1995).
Scorsese mellett olyan ikonikus rendezőkkel is együtt dolgozott, mint Michael Ciminov (1978), vagy Michael Mann (1995), majd alkalma nyílt arra, hogy barátjával, Al Pacinóval együtt álljon a kamerák elé.
Rendezőként az 1993-ban című filmjével debütált a filmvásznon, azonban nem adta fel színészi karrierjét sem. A kilencvenes évek második felében olyan alkotásokban tűnt fel, mint Quentin Tarantino krimije, a Jackie Brown (1997), a Copland vagy a Ronin (1998) Jean Renóval.
A kétezres években is töretlen népszerűségnek örvendő színész több tucat filmben játszott, és a legkülönbözőbb műfajú alkotásokban tűnt fel. Szerepelt vígjátékban (Még egy kis pánik – 2002, Last Vegas – 2013), akciófilmben (Machete – 2010, Válogatott gyilkosok – 2011) és drámákban ( Amerikai botrány – 2013) is. Mellékszerepet játszott a 2019-es Jokerben és újra Scorsese-vel valamint Al Pacinóval forgatta az epikus gengszterdrámát, Az Írt (2019).
De Niro résztulajdonosa a Nobu nevű japán étteremláncnak, amelyet még az 1990-es években kezdett kiépíteni egy japán séffel, Nobuyuki (Nobu) Matsuhisal.
Első feleségétől, a színésznő Diahnne Abbott-tól 1988-ban vált el, 1997-ben vette el második feleségét, a szintén színésznő Grace Hightowert, akivel 2018-ban válással végződött a kapcsolatuk. Hat gyermeke született.