Penélope Cruz Sánchez Madridban, Spanyolországban született 1974. április 28-án. Édesanyja, Encarna Sánchez fodrász, édesapja, Eduardo Cruz autószerelő. Két fiatalabb testvére van, Mónica, aki szintén színésznő, és Eduardo, aki énekes lett.
Penélope fiatalkorában nem vágyott színésznői karrierre, sokkal jobban vonzotta a tánc: évekig tanult klasszikus balettet a Spanyol Nemzeti Konzervatóriumban és New Yorkban.
A filmszakma kamaszkorában Pedro Almodóvar hatására kezdte el érdekelni. Meghallgatásokra kezdett járni és ügynököt keresett, ám fiatal kora miatt sok helyről elutasították, végül 1989-ben, 15 éves korában sikerrel járt. Egy tehetségkutató ügynökség a szárnyai alá vette, és Cruz több klipben és tévéműsorban is feltűnt. A filmes debütálás sem váratott sokat magára, 1992-ben szerepet kapott az El laberinto griego című filmben.
Cruz nevét a Sonka, sonka (1992) kapcsán ismerte meg a szakma, de még ugyanebben az évben az Oscar-díjas Belle epoque (1992) című filmben is feltűnt, majd sorra kapta a szerepeket spanyol és olasz filmekben.
1997-ben lehetőséget kapott, hogy együtt dolgozzon Pedro Almodóvarral a Eleven hús (1997) című filmben, majd megkapta az Nyisd ki a szemed (1997) egyik szerepét. A spanyol film 8 Goya-díjat nyert, azonban a közönség körében nem aratott osztatlan sikert. Az alkotást néhány évvel később Cameron Crowe újrarendezte (Vanília égbolt – 2001). A főszerepet ismét Cruz kapta, filmbéli partnerét Tom Cruise alakította.
Penélope első angol nyelvű szerepét a The Hi-Lo Country (1998) című filmben kapta, majd főszerepet játszott az Álomlány (1998) című drámában, alakításáért Goya-díjat kapott.
Karrierjében az áttörést Pedro Almodóvar Mindent anyámról (1999) című filmjének köszönheti, amely már a tengerentúlon is sikert aratott. Ezt követően olyan filmekben kapott szerepet, mint a Terítéken a nő (2000), a Vad lovak (2000) Matt Damonnal, és a Betépve (2001) Johnny Deppel.
Pályafutása az ezredforduló után is töretlen maradt, játszott Nicolas Cage-dzsel a Corelli kapitány mandolinja (2001) című filmben, a Tulipános Fanfan (2003) és a Gothika (2003) című alkotásokban, majd Salma Hayek partnereként leforgatta a Las Bandidas (2006) című kalandfilmet.
Cruz a közönségsiker mellett a szakmai elismerést is megkapta: a Pedro Almodóvar rendezésében bemutatott Volver (2006) már Oscar-jelölést hozott neki, majd Woody Allen Vicky Cristina Barcelona (2008) című filmjében nyújtott alakításáért megkapta az Akadémia aranyszobrát.
2012-ben és 2013-ban mindkét rendezővel alkalma volt újra együtt dolgozni a Rómának szeretettel (2012, Woody Allen) és a Szeretők, utazók (2013, Pedro Almodóvar) című filmek forgatásán.
Játszott továbbá a pozitív kritikai fogadtatásban részesült Kilencben (2009), és a népszerű kalandfilm sorozat utolsó részében, A Karib-tenger kalózai: Ismeretlen vizeken (2011) című produkcióban. Legutóbb A jogász (2013) című alkotásban láthattuk. 2016-ban a Zoolander 2-ben bukkant fel, majd Javier Bardem mellett látható volt az Escobar című film főszerepében. 2018-ban a Mindenki tudja című filmben szerepelt, a következő években pedig olyan nagysikerű produkciókban vállalt szerepet, mint a Fájdalom és dicsőség, a Párhuzamos anyák, melyért ismét Oscar-díjra jelölték, az Út a díjesőig és a 355.

Cruz 2007-ben kezdett el randizni Javier Bardemmel, akivel 2010-ben összeházasodtak. Két gyermekük született, Leonardo és Luna.