Williem Dafoe már gyermekkorában élénk érdeklődést mutatott a filmezés iránt, és már egészen fiatalon már a Milwaukee székhelyű kísérleti szánházhoz, a Theatre X-hez. 1997-ben New Yorkba költözött, ahol az avantgárd drámatársulat, a The Performance Group színészeként tevékenykedett. Feleségével, a rendező Elisabeth LeCompte-tal együtt megalapították a The Wooster Group nevű alternatív színházi társulatot. A komor és félelmet keltő tekintetéről ismert színész többnyire negatív szereplőként tűnt fel a filmvásznon. Egyik legjobb alakítása az Élni és meghalni Los Angelesben(1985) című filmben az aljas alvilági bűnöző Eric Masters megformálásához köthető.

Karrierjének fordulópontját Oliver Stone 1986-os filmje, A szakasz jelentette, melyért a legjobb férfi mellékszereplő Oscar-díjára is jelölték. 1988-ban pályafutásának talán két legjelentősebb szerepét kapta Scorsese Krisztus utolsó megkísértése című megosztó filmjében valamint Alan Parker a Lángoló Mississippi című alkotásában, ahol egy FBI ügynök szerepében tűnt fel. Ezt követően egy újabb Oliver Stone filmben, a Született július negyedikénben (1989) kapott szerepet, de emlékezetes alakítást nyújtott az 1996-os Az angol betegben, a kultikus Amerikai pszichóban (2000) valamint A vámpír árnyéka (2000) című moziban is, melyért másodszorra is Oscar-díjra jelölték.
Néhány kevésbé sikeres film után William Dafoe visszatért a karrierjét mindvégig szegélyező erős szerepekhez, és olyan kiváló alkotásokban láthatta őt a nagyközönség, mint A harag tüze (2013), A nimfomániás 2. rész (Nagypolgári nimfománok 2) (2013), a Csillagainkban a hiba (20141) vagy A Grand Budapest Hotel (2014).

A 2010-es évek második felében is halmozta a kiváló alakításokat. Előbb a Gyilkosság az Orient expresszen (2017) című krimiben, de még ugyanebben az évben debütált a Floridai álom, melyért Oscar-díjra jelölték. Szerepet kapott a DC szuperhősfilmjében, az Aquamanben (2018), melyet ismét egy alacsonyabb költségvetésű filmj, A világítótorony (2019) követett. A 2021-es egy kisebb mellékszerep erejéig visszatért Zöld Manó szerepében a Pókember: Nincs hazaútban, de emlékezetes volt Robert Eggers vikinges bosszúfilmje, Az Északi (2021) is.